ABSTRACT
Resumen En el presente estudio se describe un flujo de trabajo que puede ser aplicado a diferentes especies vegetales, con el fin de obtener extractos apoplásticos que puedan ser usados para análisis proteómicos. Para ello, usando tallos y raíces de clavel, se evaluaron parámetros claves para la extracción de estas proteínas. Se determinó que para esta especie (Dianthus caryophyllus L.) se debe usar la solución amortiguadora fosfato de sodio 0,1 M pH 6,5, cloruro de sodio 50 mM y 0,1% β-mercaptoetanol para la infiltración; con tres tiempos de vacío de 20 s a 70 kPa y centrifugación a 1000 x g durante 20 min a 4 °C, seguido de precipitación y concentración de proteínas con el método Ácido tricloroacético/acetona. Bajo estas condiciones, se obtienen extractos que permiten análisis electroforéticos en 2D de proteínas de apoplasto, usando para el isolectroenfoque tiras con gradientes de pH 5-8 para raíz y pH 3-10 para tallo. Las condiciones descritas permitirán profundizar sobre el papel de las proteínas apoplásticas en diversidad de fenómenos biológicos que involucren esta especie vegetal.
Abstract In the present study a workflow, that can be applied to different plant species, to obtain a high quality apoplastic extract and for proteomic analysis is described. For that, using carnation roots and stems, some important parameters for the extraction of these proteins were evaluated. The best conditions for the infiltration were provided by using a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.5, 50 mM sodium chloride and β -mercaptoethanol 0.1%, with 3 vacuum times at 70 kPa for 20 s and centrifuged at 4°C at 1,000 g for 20 min, and then a subsequent protein precipitation and concentration with the Trichloroacetic acid/acetone protocol. These conditions can be used to obtain a good quality extract for 2D electrophoretic analysis of apoplastic proteins. Strips with pH gradients between 5-8 and 3-10 were used to run isoelectric analysis for extracts obtained from apoplast in roots and stems, respectively. The conditions described can be used to perform studies focused on apoplastic proteins and its role in biological phenomena involving this plant species.
Resumo No presente estudo, é descrito um fluxo de trabalho que pode ser aplicado a espécies vegetais diferentes, para obter extratos apoplásticos que podem ser utilizados para análise proteômico. Para isto, utilizando os caules e as raízes do cravo, foram avaliados parâmetros considerados chave para a extração destas proteínas. Foi determinado que para esta espécie, deve ser utilizada uma solução tampão de fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5 com cloreto de sódio 50 mM e 0,1% β-mercaptoetanol para a infiltração; com três aplicações de vácuo de 20 s a 70 kPa e centrifugação a 1000 x g por 20 minutos a 4°C, e subsequente precipitação e concentração de proteínas usando Ácido ricloroacético/acetona. Nestas condições se podem obter extratos que permitem a análise eletroforética 2D de proteínas do apoplasto utilizando para a focalização isoeléctrica tiras com gradientes de pH 5-8 para a raiz e de pH 3-10 para o caule. As condições descritas permitirão aprofundar sobre o papel das proteínas apoplásticas numa diversidade de fenômenos biológicos que envolvem esta espécie de planta.
ABSTRACT
En el presente trabajo se verificó la presencia de algunas enzimas relacionadas con la pared celular vegetal (poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa y xilanasa) en raíces de clavel (Dianthus caryophyllus L.). Así mismo, se determinaron los niveles de actividad de las mismas. Estos niveles se analizaron en diferentes espacios celulares: en el fluido intercelular que hace parte del apoplasto, en el simplasto y en el tejido total de las raíces de clavel (apoplasto y simplasto). Para extraer el fluido intercelular, se ensayaron dos metodologías. Para obtener el contenido intracelular (simplasto) y el extracto total (apoplasto y simplasto) en raíces de clavel se ensayaron tres metodologías que utilizaban como solución i) extractante buffer fosfato, ii) buffer fosfato con PVPP y iii) lavados con acetona a las raíces de clavel, antes de la extracción con buffer fosfatos. Los resultados mostraron el efecto de las diferentes soluciones en las actividades enzimáticas y en el contenido de proteína. Se propuso una de estas metodologías para extraer las cuatro enzimas en un único paso y realizar análisis comparativo de actividad enzimática.
The presence of some enzymes related to cell wall (polygalacturonase, the pectate lyase, protease and xylanase) in carnation (Dianthus caryophyllus L.) roots as well as the activity levels were determined. These levels were analyzed in different cellular places: the intercellular fluid that is part of the apoplast, the symplast, and the total level (apoplast and symplast) in carnation roots. Two methods were tested to extract the intercellular fluid. To obtain the intracellular content (symplast) and total extract (apoplast+symplast), three methods were tested, using as extracting solution i) phosphate buffer, ii) phosphate buffer + PVPP, iii) before the extraction with phosphate buffer, the carnation roots were washed with acetone. The results showed the effect of different extracting solutions in the enzymatic activities and in the protein content. A new only one step method is proposed to extract the four enzymes and make the comparative analysis of enzymatic activity.
No presente trabalho foi evidenciada a presença de algumas enzimas relacionadas com a parede celular vegetal: poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa e xilanasa e se determinaram seus níveis de atividade, em raízes de cravo (Dianthus caryophyllus L.). Os níveis se analisaram em diferentes espaços celulares: no fluido intercelular que faz parte do apoplasto, no simplasto e no tecido total das raízes de cravo (apoplasto e simplasto). Foram avaliadas duas metodologias para extrair o fluido intercelular. Para obter o conteúdo intracelular (simplasto) e o extrato total (apoplasto e simplasto) se avaliaram três metodologias que utilizavam como solução extratora i) buffer fosfato, ii) buffer fosfato com PVPP e iii) lavados com acetona às raízes de cravo, antes da extração com buffer fosfato. Os resultados mostraram o efeito das diferentes soluciones nas atividades enzimáticas e no conteúdo de proteína. Se propõem uma de estas metodologias para extrair as quatro enzimas num único passo e realizar a analise comparativa da atividade enzimática.
ABSTRACT
Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
ABSTRACT
Se evaluó la actividad enzimática peroxidasa (POD) y el contenido de lignina en tallos de esquejes de clavel (Dianthus cayophyllus L.) inoculados con el hongo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod) raza 2, con el fin de determinar su posible participación en la respuesta de defensa y en la resistencia de la planta al marchitamiento vascular. Inicialmente se seleccionaron las condiciones para la extracción y determinación de la actividad enzimática. Se encontró que el tratamiento con buffer citrato 100 mM pH 5,0 con 3% de PVPP presentó los mejores resultados de actividad peroxidasa para la extracción de la enzima a partir de tallos de clavel. Se determinaron las mejores condiciones para la medida de actividad enzimática POD a través de la reacción de oxidación de o-dianisidina con H2O2 seguida a 460 nm. Una mezcla de reacción con una concentración 0,6 mM de o-dianisidina y 2,0 mM de H2O2 en buffer citrato 100 mM a pH 5,5 y 45°C, presentó los mejores resultados para la cuantificación de la enzima. Una vez establecidas las condiciones, esquejes de clavel de una variedad tolerante y una susceptible al marchitamiento vascular fueron inoculados con el patógeno y se evaluaron los niveles de actividad de POD y de acumulación de lignina a diferentes tiempos pos-inoculación. La variedad tolerante (Bárbara), presentó inducción de dicha enzima a las 8 y 48 h pos-inoculación y aumento en el contenido de lignina a 48 y 72 h. A su vez, en la variedad susceptible (Delphi) no se encontraron cambios significativos en los niveles de POD ni en el contenido de lignina. Se estableció, por tanto, que la inducción de la actividad POD está asociada a la lignificación, que a nivel del tallo, hace parte de los mecanismos asociados a defensa en el modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Peroxidase (POD) enzymatic activity and lignin content in carnation stems (Diant-hus cayophyllus L.) infected with the fungus Fusarium oxysporum f.sp. dianthi race 2 were evaluated with the purpose of determining the possible enzyme participation in the plant defense response and in the resistance to the vascular wilting. Initially, the conditions for extraction and determination of enzymatic activity were selected. It was found that when citrate buffer 100 mM pH 5.0 with 3% PVPP was employed, the results of POD activity in enzyme extract obtained from carnation stems were higher. Best conditions were set for POD activity measure through oxidation reaction of o-dianisidine and H2O2 at 460 nm. A reaction mixture with a concentration of o-dianisidine 0,6mM and H2O2 2.0 mM in citrate buffer 100 mM pH 5.5 at 45 ºC displayed the best results for enzyme quantification. Once conditions were established, tolerant and susceptible vascular wilting carnation cuttings were inoculated with the pathogen. In each treatment at stem level, different postinoculation times were evaluated for enzyme activity levels and lignin accumulation. Tolerant variety (Barbara) showed a POD induction at 8 and 48 h pos-inoculation and an increase in lignin content at 48 and 72 h. At the same time, in susceptible variety (Delphi) there were no significant changes in POD levels or lignin contents. Therefore, it was established that POD activity induction is associated to lignification which, at stem level, is part of the mechanisms associated to defense in carnation (Dianthus caryophyllus L.) against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Foram avaliadas a actividade enzimática peroxidasa (POD) e o conteúdo de lignina em talos de estacas de cravo (Dianthus cayophyllus L.) inoculados com o fungo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2, com o propósito de determinar a sua possível participação na resposta de defensa e à resistência da planta ao murchamento vascular. Inicialmente foram seleccionadas as condiciones para a extracção e determinação da actividade enzimática. Foi encontrado que o tratamento com buffer citrato 100 mM pH 5,0 com 3% de PVPP, apresentou os melhores resultados de actividade peroxidasa na extracção da enzima a partir de talos de cravo. Foram determinadas as melhores condições para medir a actividade enzimática POD a través da reacção de oxidação de o-dianisidi na com H2O2 e com seguimento a 460 nm. Uma mistura de reacção com uma concentração 0,6 mM de o-dianisidina e 2,0 mM de H2O2 em buffer citrato 100 mM a pH 5,5 e 45 °C, apresentou os melhores resultados para a quantificação da enzima. Uma vez estabelecidas as condições, estacas de cravo de uma variedade tolerante e uma susceptível ao murchamento vascular foram inoculadas com o fungo patogénico, e se avaliaram a diferentes tempos pos-inoculação os níveis de actividade desta enzima e de acumulação de lignina. A variedade tolerante (Bárbara), apresentou uma indução de POD às 8 e 48 h pos-inoculação e um aumento no conteúdo de lignina às 48 y 72 h. Por outro lado, na variedade susceptível (Delphi) não se encontraram mudanças significativas nos níveis de POD nem no conteúdo de lignina. Se estabeleceu, por tanto, que a indução da actividade POD está associada à lignificação que a nível de talo faz parte dos mecanismos associados à defesa no modelo cravo-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2.
ABSTRACT
Se evaluó la inducción de peroxidasa en frutos de lulo con el fin de determinar su participación en las respuestas bioquímicas hacia el patógeno Colletotrichum acutatum, causante de la antracnosis. Se establecieron como mejores condiciones para su extracción y para determinación de la actividad: buffer fosfatos 100 mM pH 7, 1% SDS y 1 % PVPP; sustrato guayacol 15 mM, peróxido de hidrógeno 10 mM, pH 6,5, 55 °C y 30 µL de extracto. Se realizó un ensayo in vivo usando frutos verdes, pintones y maduros, inoculados con el hongo o con agua estéril. Se determinó la actividad peroxidasa a diferentes horas a partir de la inoculación, encontrándose una respuesta diferencial con el tiempo por efecto de la presencia del patógeno, y según el estado de madurez de los frutos. En lulos verdes inoculados con el hongo se observó aumento en la actividad al cabo de 6 y 144 horas. En lulos pintones no se observó efecto notable, mientras que en maduros el aumento en actividad fue prácticamente a todos los tiempos. Los resultados del contenido de fenoles totales mostraron que hubo acumulación a 96 y 144 horas por efecto del patógeno, para lulos en estado verde y maduro, mientras que para pintones, en los que se presentaron más rápido y con mayor severidad los síntomas de la antracnosis, no se observó aumento a ninguno de los tiempos. En los frutos más enfermos, el cambio en actividad peroxidasa y en contenido total de fenoles fue menos evidente, por lo que se sugiere una relación inversa de estos con el desarrollo de la antracnosis.
The induction of peroxidase in lulo fruits was evaluated in order to determine its participation in the biochemical responses towards the pathogen Colletotrichum acutatum, which causes the antrachnosis disease. For extraction and activity determination, these conditions were established as the best: buffer phosphates 100 mM pH 7, 1% SDS y 1 % PVPP; substrate guaiacol 15 mM, hydrogen peroxide 10 mM, pH 6,5, 55 °C and 30 µL of the extract. An in vivo test was developed using unripe, semi-ripe and ripe fruits, inoculated with the fungus or sterile water. The peroxidase activity was measured at different hours starting from the inoculation, finding a time differential response caused by the pathogen presence and according to the maturity state of fruits; in unripe lulo fruits inoculated with the fungus, an increase of the activity was observed after 6 and 144 hours. In semi-ripe fruits no considerable effect was seen, while in ripe fruits the increase of the activity was found practically at all times. The results of the measured total phenol content, showed accumulation at 96 and 144 hours as a result of the pathogen presence in unripe and ripe fruits, while for semi-ripe fruits, in which the antrachnosis symptoms were noticed faster and more severely, no phenol increase was found at any time. The less evident changes seen in peroxidase and phenol content, using severely affected fruits by the disease, suggest an inverse relationship between these parameters and the development of the antrachnosis.
A indução da peroxidasa foi avaliada na casca de frutos de lulo com a finalidade de determinar a sua possível participação em reacções de defesa contra o patógeno Colletotrichum acutatum, causador da doença antracnose. Foram estabelecidas as melhores condições para a sua extracção e para medir a actividade da enzima extraída, encontrando-se que com tampão fosfato 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP, substrato guaicol 15 mM, peróxido de hidrogeno 10 mM, pH 6,5, 55 °C y 30 µL de extracto enzimático se conseguiram as actividades enzimáticas mais elevadas. Foi realizado um ensaio in vivo usando frutos verdes, em processo de maduração e maduros, inoculados com o fungo ou com água estéril. A actividade peroxidasa foi determinada a diferentes horas a partir da inoculação encontrando-se uma resposta diferencial com o tempo pelo efeito da presença ao patógeno e de acordo ao estado de madurez dos frutos. Em lulos verdes observou-se um aumento da actividade nos frutos inoculados com o fungo ao fim de 6 e 144 horas. Em lulos em processo de maduração, o patógeno não teve maior efeito, enquanto que em lulos maduros o aumento na actividade da enzima, como resposta à presença do patógeno, foi praticamente a todos os tempos avaliados. Os resultados do conteúdo de fenóis totais mostraram que ouve uma acumulação significativa a 96 e 144 horas por efeito da inoculação com o patógeno para lulos em estado verde e maduro, enquanto que para os lulos em processo de maduração, nos quais se apresentaram mais rápido e com maior severidade os sintomas de antracnose, não se observou aumento em nenhum dos tempo avaliados. Nos frutos mais afectados pelos sintomas, a mudança na actividade POD e no conteúdo total de fenóis foi menos evidente, motivo pelo qual se sugere uma relação inversa de estes com o desenvolvimento de antracnose.
ABSTRACT
Con el fin de evaluar el comportamiento a nivel del tallo de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, por su nombre en inglés phenylalanine ammonia liase), durante la interacción clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2, se seleccionaron las condiciones para su extracción y cuantificación de la actividad. Para la extracción a partir de tallos y raíces se seleccionó un tratamiento previo del material vegetal con acetona y posterior extracción con buffer borato pH 8,8 con EDTA 2mMy ß-mercaptoetanol 18 mM. Para su cuantificación a nivel del tallo se debe realizar un ensayo discontinuo por 10 min, a 37 oC, pH 8,0 y a una concentración de sustrato de 35 mM. Adicionalmente se muestra mediante un ensayo in vivo el efecto que tiene, como inductor de esta enzima, la aplicación de un extracto crudo del patógeno. Los resultados observados indican que esta enzima se induce significativamente en tallos de claveles de la variedad tolerante Kiss durante el tratamiento por aspersión con el extracto crudo del patógeno, mientras que dicha inducción fue inexistente para la infección directamente con el patógeno. La inducción en esta variedad indica que en este extracto del patógeno se presentan elicitores potenciales para la inducción de esta enzima y por ende de la ruta fenilpropanoide.
The conditions of extraction and quantification of activity during interaction of carnation and Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 were selected to evaluate the dynamics of the enzyme Phenylalanine Ammonium Lyase (PAL) at the carnations steam. For the extraction from roots and stems a previous treatment with acetone and extraction with borate pH 8.8, EDTA 2 mMand mercaptoethanol 18 mM buffer were selected. For the quantification at steam level a discontinous assay for 10 min at 37 °C, pH 8.0 and substrate concentration 35mMshould be done. In addition an in vivo assay shows the effect that the applications of a raw extract of the pathogen as inductor of this enzyme. The results show that the enzyme is significantly induced in carnations stems of the tolerant variety Kiss during the treatment by aspersion with raw extract of the pathogen while the induction was non existing for direct infection with the pathogen. The induction in this variety shows that in the pathogen extract are present elicitors for the induction of this enzyme and thus the phenylpropanoid path.
Para avaliar o comportamento da enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, pelo seu nome em inglês phenylalanine ammonia liase) no caule durante a interação cravo- Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2, foram seleccionadas as condiçes ideais para a sua extração e quantificação na atividade. Para a extração a partir de caules e raízes foi seleccionado um tratamento prévio do material vegetal com acetona e posterior extração com borato pH 8,8 com EDTA 2 mMe ß-mercaptoetanol 18 mM. Para a quantificação da enzima no caule, deve-se realizar um ensaio descontínuo por 10 min., a 37 °C, pH 8,0 e a uma concentração de substrato de 35 mM. Além do mais, mostra-se mediante um ensaio in vivo, o efeito que tem como inductor desta enzima a aplicação de um extracto cru do patógeno. Os resultados observados indicam que esta enzima é induzida significativamente en caules de cravos da variedade tolerante Kiss durante o tratamento por aspersão com o extrato cru do patógeno, enquanto que esta indução foi inexistente para a infecção directa com o patógeno. A indução apresentada nesta variedade indica que neste extrato do patógeno estão presentes potencias elicitores para a indução desta enzima e portanto da rota fenilpropanoide.
ABSTRACT
Se estudió por ensayos in vitro la posible participación de las enzimas endopoligalacturonasa (PG) (EC.3.2.1.15) y pectato liasa (PL) (EC.4.2.2.2), consideradas factores de virulencia en el proceso de infección del clavel por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD). Los resultados muestran la inducción de la expresión de la enzima PG en presencia de los inductores artificiales, ácido poligalacturónico (APG) y pectina, y un nivel de expresión muy bajo en cultivos con pared celular (PC) de clavel de variedades resistente y susceptible. La enzima PL no presentó expresión en presencia de inductores artificiales (APG y pectina), mientras que en cultivos inducidos con pared celular de raíz presentó un alto nivel de expresión.
The Polygalacturonase (PG; EC 3.2.1.15) and the Pectate lyase (PL; EC 4.2.2.2) are considered as factor of virulence. These enzymes were studied during the infection process of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD) on Carnation (Dianthus caryophillus L.) using culture medium in vitro. The results show the induction of the expression of the PG enzyme when the artificial inductors polygalacturonic acid (APG) and pectin are present. The level of expression was very low in culture with cellular wall (PC) of carnations of the resistant and susceptible varieties. The PL enzyme did not show expression in the presence of artificial inductors (APG and pectin) but in induced culture with root and cellular wall showed a high level of expression.